La cromatografia è uno dei metodi per separare le sostanze. Viene utilizzato per la successiva analisi qualitativa e quantitativa delle proprietà fisiche e chimiche delle microparticelle. Una variante di questa tecnologia è la cromatografia di affinità. L'idea di differenziare i composti proteici utilizzando la proprietà dell'affinità molecolare è nota nella scienza da diversi decenni. Tuttavia, ha ricevuto il suo sviluppo solo negli ultimi anni, dopo l'introduzione di materiali idrofili altamente porosi utilizzati come matrice. Questo metodo permette di risolvere sia problemi analitici (separazione delle sostanze e loro identificazione) sia problemi preparativi (depurazione, concentrazione).
Essenza
La cromatografia di affinità (dal latino affinis - “adiacente”, “correlato”) si basa su interazioni di affinità, che sono la formazione di legami altamente specifici tra una molecola spaziatrice (ligando o affinante) e una molecola bersaglio. Questi meccanismi sono diffusi in natura (connessione di mediatori o ormoni e recettori, anticorpi eantigeni, ibridazione di polinucleotidi e altri tipi di processi). In medicina, la cromatografia di affinità è stata utilizzata per scopi pratici dal 1951
I componenti sono separati come segue:
- La soluzione di lavoro contenente la sostanza da isolare viene fatta passare attraverso il sorbente;
- il ligando depositato sulla matrice assorbente trattiene questa sostanza;
- è concentrato (accumulo);
- estrazione della sostanza isolata dal sorbente mediante lavaggio con un solvente.
Questo metodo ti consente di isolare celle intere. La differenza rispetto alla tradizionale cromatografia ad assorbimento è che esiste un forte legame biospecifico del componente isolato con il sorbente, che è caratterizzato da un'elevata selettività.
Adsorbenti
Le seguenti sostanze sono usate come adsorbenti:
- Composti gel a base di agarosio, un polisaccaride ottenuto dall'agar. Le più comunemente utilizzate sono 3 varietà: sefarosio 4B, CL (agarosio reticolato) e affi-gel. Quest'ultima composizione è un gel modificato di agarosio e poliacrilammide. Ha una maggiore inerzia biologica, un'elevata resistenza chimica e termica.
- Silice (gel di silice).
- Vetro.
- Polimeri organici.
Per eliminare gli ostacoli meccanici durante il contatto con il ligando, vengono utilizzate sostanze aggiuntive per separarlo dal vettore (peptidi, diammine, poliammine, oligosaccaridi).
Attrezzature
Le apparecchiature per cromatografia di affinità includono le seguenti unità principali:
- serbatoi di accumulo per la fase mobile (eluente);
- pompe ad alta pressione per alimentazione media (il più delle volte alternative);
- filtro per la pulizia degli eluenti dalla polvere;
- dispositivo dosatore;
- colonna cromatografica per la separazione delle miscele;
- rilevatore per il rilevamento di componenti separati in uscita dalla colonna;
- registratori di cromatogrammi e unità a microprocessore (computer).
Per ridurre la quantità di aria disciolta, l'elio viene prima fatto passare attraverso la fase mobile. Per modificare la concentrazione dell'eluente sono installate diverse pompe controllate dal programmatore. Le colonne cromatografiche sono realizzate in acciaio inossidabile (per requisiti elevati di resistenza alla corrosione), vetro (opzione universale) o acrilico. A scopo preparatorio, il loro diametro può variare da 2 a 70 cm Nella cromatografia analitica si utilizzano microcolonne Ø10-150 µm.
Per aumentare la sensibilità dei rivelatori, nella miscela vengono introdotti dei reagenti che contribuiscono alla formazione di sostanze che assorbono più raggi nella regione ultravioletta o visibile dello spettro.
Metodologia
Ci sono 2 tipi principali di cromatografia di affinità liquida:
- Colonna, in cui la colonna viene riempita con una fase stazionaria e una miscela viene fatta passare attraverso di essa con un flussoeluente. La separazione può avvenire sotto pressione o per gravità.
- Strato sottile. L'eluente si muove lungo lo strato adsorbente piatto sotto l'influenza delle forze capillari. L'adsorbente viene applicato su una lastra di vetro, un'asta di ceramica o di quarzo, un foglio di metallo.
Le fasi principali del lavoro includono:
- preparazione dell'adsorbente, fissaggio del legante sul supporto;
- alimentazione della miscela di separazione nella colonna cromatografica;
- Caricamento di fase mobile, legame dei componenti tramite ligando;
- fase di sostituzione per isolare la sostanza legata.
Destinazione
La cromatografia di affinità viene utilizzata per isolare i seguenti tipi di sostanze (tra parentesi il tipo di ligando utilizzato):
- analoghi di inibitori enzimatici, substrati e cofattori (enzimi);
- sostanze bioorganiche con segni di estraneità genetica, virus e cellule (anticorpi);
- carboidrati ad alto peso molecolare, polimeri monosaccaridi, glicoproteine (lectine);
- proteine nucleari, nucleotidiltransferasi (acidi nucleici);
- recettori, proteine di trasporto (vitamine, ormoni);
- proteine che interagiscono con le membrane cellulari (cellule).
Questa tecnologia viene utilizzata anche per ottenere enzimi immobilizzati e legandoli alla cellulosa consente la produzione di immunosorbenti.
Cromatografia delle proteine che legano il DNA
L'isolamento delle proteine che legano il DNA viene eseguito utilizzandoeparina. Questo glicosaminoglicano è in grado di legare un'ampia gamma di molecole. La cromatografia di affinità delle proteine di questo gruppo viene utilizzata per isolare sostanze come:
- fattori di inizio e allungamento della traslazione (sintesi di molecole e proteine di acido nucleico);
- restrictasi (enzimi che riconoscono determinate sequenze nel DNA a doppio filamento);
- DNA ligasi e polimerasi (enzimi che catalizzano l'unione di due molecole per formare un nuovo legame chimico e sono coinvolti nella replicazione del DNA);
- inibitori della proteasi della serina che svolgono un ruolo importante nei processi immunitari e infiammatori;
- fattori di crescita: fibroblasti, Schwann, endoteliali;
- proteine della matrice extracellulare;
- recettori ormonali;
- lipoproteine.
Dignità
Questo metodo è uno dei più specifici per l'isolamento dei composti reattivi (enzimi e aggregati più grandi - virus). Tuttavia, viene utilizzato non solo per isolare sostanze biologicamente attive.
Rilevamento di anticorpi in piccole quantità, valutazione quantitativa dell'acido poliadenilico, determinazione rapida delle masse molecolari delle deidrogenasi, rimozione di alcuni inquinanti, studio della cinetica di attivazione della forma inattiva della tripsina, della struttura molecolare dell'uomo interferoni: questo non è l'intero elenco di studi in cui viene utilizzata l'affinità cromatografia. L'uso in clinica è dovuto ai suoi vantaggi quali:
- Capacità di pulizia efficaceproteine, polisaccaridi, acidi nucleici. Differiscono leggermente nelle loro proprietà fisiche e chimiche e perdono attività durante l'idrolisi, la denaturazione e altri tipi di trattamento utilizzati in altri metodi.
- La velocità di separazione delle sostanze, la natura dinamica del processo.
- Non c'è bisogno di una speciale purificazione enzimatica e omogeneizzazione isoenzimatica per determinare le costanti di dissociazione.
- In grado di separare un'ampia gamma di sostanze.
- Basso consumo di ligandi.
- Possibilità di separazione di sostanze in grandi volumi.
- Processo reversibile di legame delle macromolecole biologiche.
Questa tecnica può essere combinata con altre, per imporre un campo aggiuntivo (gravitazionale, elettromagnetico). Ciò consente di espandere le capacità tecniche della cromatografia.
Ingegneria enzimatica
Grazie a questo metodo è iniziato lo sviluppo attivo di una nuova branca della biotecnologia: l'ingegneria enzimatica.
La cromatografia di affinità per l'isolamento degli enzimi presenta i seguenti vantaggi:
- ottenere enzimi in grandi quantità grazie al minor tempo, di conseguenza - la loro riduzione del prezzo;
- l'immobilizzazione degli enzimi può ampliare significativamente l'ambito della loro applicazione nella medicina e nell'industria;
- L'associazione degli enzimi con un supporto solido insolubile permette di studiare l'influenza del microambiente e la direzione delle reazioni, che svolgono un ruolo importante nei processi naturali e fisiologici.
