Il DNA ricombinante sono molecole formate da tecniche di ricombinazione genetica di laboratorio per combinare materiale genetico da più fonti. È possibile perché le molecole di DNA di tutti gli organismi hanno la stessa struttura chimica e differiscono solo per la sequenza nucleotidica al suo interno.
Creazione
La clonazione molecolare è un processo di laboratorio utilizzato per creare DNA ricombinante. È uno dei due metodi più utilizzati, insieme alla reazione a catena della polimerasi (PCR). Ti permette di controllare la replicazione di qualsiasi particolare sequenza di DNA scelta dallo sperimentatore.
Ci sono due differenze fondamentali tra i metodi del DNA ricombinante. Uno è che la clonazione molecolare implica la replicazione in una cellula vivente, mentre la PCR coinvolge in vitro. Un' altra differenza è che il primo metodo consente di tagliare e incollare sequenze di DNA, mentre il secondo è migliorato copiando l'ordine esistente.
DNA del vettore
Per ottenere il DNA ricombinante è necessario un vettore di clonazione. È derivato da plasmidi o virus ed è un segmento relativamente piccolo. La scelta del vettore per la clonazione molecolare dipende dalla scelta dell'organismo ospite, dalla dimensione del DNA da clonare e dall'eventuale espressione di molecole estranee. I segmenti possono essere combinati utilizzando vari metodi come la clonazione di enzimi di restrizione/ligasi o l'assemblaggio di Gibson.
Clonazione
Nei protocolli standard, la clonazione prevede sette passaggi.
- Seleziona l'organismo ospite e il vettore di clonazione.
- Ottenere un vettore del DNA.
- Formazione di DNA clonato.
- Creazione di DNA ricombinante.
- Introducendolo nell'organismo ospite.
- Selezione degli organismi che lo contengono.
- Selezione di cloni con inserti di DNA desiderati e proprietà biologiche.
Dopo il trapianto nell'organismo ospite, le molecole estranee contenute nel costrutto ricombinante possono o non possono essere espresse. L'espressione richiede la ristrutturazione del gene per includere le sequenze necessarie per la produzione del DNA. Viene utilizzato dalla macchina di traduzione dell'host.
Come funziona
Il DNA ricombinante funziona quando la cellula ospite esprime una proteina da geni ricombinanti. L'espressione dipende dal circondare il gene con una serie di segnali che forniscono istruzioni per la sua trascrizione. Includono il promotore, il legame del ribosoma e il terminatore.
I problemi sorgono se il genecontiene introni o segnali che agiscono come terminatori per l'ospite batterico. Questo porta alla cessazione anticipata. La proteina ricombinante può essere elaborata, piegata o degradata in modo improprio. La sua produzione nei sistemi eucariotici avviene solitamente nei lieviti e nei funghi filamentosi. L'uso di gabbie per animali è difficile a causa della necessità di una solida superficie di appoggio per molti.
Proprietà degli organismi
Gli organismi contenenti molecole di DNA ricombinante hanno fenotipi apparentemente normali. Il loro aspetto, comportamento e metabolismo di solito non cambiano. L'unico modo per dimostrare la presenza di sequenze ricombinanti è esaminare il DNA stesso utilizzando il test di reazione a catena della polimerasi.
In alcuni casi, il DNA ricombinante può avere effetti dannosi. Ciò può accadere quando il suo frammento contenente un promotore attivo si trova accanto a un gene della cellula ospite precedentemente silenzioso.
Usa
La tecnologia del DNA ricombinante è ampiamente utilizzata nella biotecnologia, nella medicina e nella ricerca. Le sue proteine e altri prodotti possono essere trovati in quasi tutte le farmacie occidentali, cliniche veterinarie, studi medici, laboratori medici o biologici.
L'applicazione più comune è nella ricerca di base, dove la tecnologia è essenziale per gran parte del lavoro odierno nelle scienze biologiche e biomediche. Il DNA ricombinante viene utilizzato per identificare, mappare e sequenziare i geni e per determinarlifunzioni. Le sonde rDNA vengono utilizzate per analizzare l'espressione genica in singole cellule e nei tessuti di interi organismi. Le proteine ricombinanti sono usate come reagenti negli esperimenti di laboratorio. Alcuni esempi specifici sono riportati di seguito.
Chimosina ricombinante
Trovato nell'abomaso, la chimosina è un enzima necessario per fare il formaggio. È stato il primo additivo alimentare geneticamente modificato utilizzato nell'industria. Un enzima ricombinante prodotto microbiologicamente, strutturalmente identico a un enzima derivato dal vitello, è più economico e prodotto in quantità maggiori.
Insulina umana ricombinante
Sostituito virtualmente l'insulina di origine animale (es. suini e bovini) per il trattamento del diabete insulino-dipendente. L'insulina ricombinante viene sintetizzata introducendo il gene dell'insulina umana nei batteri del genere Eterichia o lievito.
Ormone della crescita
Prescritto per i pazienti la cui ghiandola pituitaria non produce abbastanza ormone della crescita per supportare il normale sviluppo. Prima che l'ormone della crescita ricombinante diventasse disponibile, veniva ottenuto dalla ghiandola pituitaria dei cadaveri. Questa pratica pericolosa ha portato alcuni pazienti a sviluppare la malattia di Creutzfeldt-Jakob.
Fattore della coagulazione ricombinante
Questa è una proteina della coagulazione del sangue che viene somministrata a pazienti con forme di emofilia con disturbi emorragici. Non sono in grado di produrrefattore VIII in quantità sufficiente. Prima dello sviluppo del fattore VIII ricombinante, la proteina veniva prodotta elaborando grandi quantità di sangue umano da più donatori. Ciò comportava un rischio molto elevato di trasmissione di malattie infettive.
Diagnosi dell'infezione da HIV
Ciascuno dei tre metodi ampiamente utilizzati per diagnosticare l'infezione da HIV è stato sviluppato utilizzando il DNA ricombinante. Un test anticorpale usa la sua proteina. Rileva la presenza di materiale genetico dell'HIV utilizzando la reazione a catena della polimerasi di trascrizione inversa. Lo sviluppo del test è stato reso possibile dalla clonazione molecolare e dal sequenziamento dei genomi dell'HIV.
