La citometria a flusso è un metodo di ricerca citologica utilizzato per l'analisi approfondita delle cellule. Il suo vantaggio è che ti permette di studiare ogni cellula individualmente. Questo tipo di analisi aiuta a valutare diversi parametri in centinaia di celle in pochi secondi. Di conseguenza, la citofluorimetria è considerata uno dei metodi di analisi più rapidi e accurati attualmente disponibili per scienziati e medici.
Principio
Il principio della citometria a flusso si basa sulla misurazione della diffusione della luce e della luminescenza (fluorescenza) delle cellule. La sospensione cellulare viene fatta passare come un flusso ad alta velocità attraverso la cellula del citometro, dove viene irradiata con un laser. Lì viene eseguita anche la cosiddetta focalizzazione idrodinamica. Il suo meccanismo è che il flusso dalla cella con le particelle studiate all'uscita fluisce nel getto esterno, che ha una velocità maggiore. Di conseguenza, le particelle sono allineate in una catena ordinata.
Le pre-celle sono etichettate con speciali coloranti fluorescenti (fluorocromi). Grazie a loro, il raggio lasereccita un bagliore secondario. I segnali luminosi ricevuti vengono registrati dai rivelatori. Successivamente, le informazioni vengono elaborate utilizzando algoritmi software che consentono di contare singole popolazioni cellulari che differiscono in alcuni criteri.
La ricerca con la microscopia convenzionale spesso non riesce a distinguere tra cellule diverse perché sembrano uguali. La citofluorimetria può fornire altri dati (integrità della struttura del DNA), analizzare l'espressione proteica, la sopravvivenza cellulare.
Poiché l'eccitazione dei fluorocromi richiede fasci di luce con diverse lunghezze d'onda, nonché diversi tipi di rivelatori, le moderne installazioni sono dotate di diversi canali di rilevamento (da 4 a 30). Il numero di emettitori laser può variare da 1 a 7. Dispositivi più complessi consentono studi multiparametro di diverse proprietà delle particelle contemporaneamente.
Vantaggi e svantaggi
I vantaggi della citometria a flusso includono:
- alta velocità di elaborazione (registrazione fino a 30mila eventi in 1 secondo);
- possibilità di studiare un gran numero di cellule (fino a 100 milioni in un campione);
- Quantificare l'intensità della luce fluorescente;
- analisi di ciascuna cella;
- studio simultaneo di processi eterogenei;
- separazione automatica dei dati per popolazioni cellulari;
- visualizzazione di qualità dei risultati.
Un' altra caratteristica di questa tecnologia è chela particella analizzata può essere colorata con diverse soluzioni fluorescenti. Grazie a ciò avviene uno studio multiparametrico.
Gli svantaggi includono la complessità dell'attrezzatura tecnica e la necessità di una preparazione speciale del campione.
Citometri
I primi dispositivi di questo tipo sono apparsi già nel 1968 in Germania, ma si sono diffusi molto più tardi. Attualmente, tutti i dispositivi che funzionano con il metodo della citometria a flusso possono essere suddivisi in 2 tipi:
- dispositivi che misurano la radiazione fluorescente (due o più lunghezze d'onda), la diffusione della luce a 10° e 90° (rilevatore di dispersione laterale e ad angolo basso);
- dispositivi che, oltre a misurare diversi parametri cellulari, ordinano automaticamente in gruppi in base a questi criteri.
Il rilevatore a dispersione diretta è progettato per determinare la dimensione della cellula e il dispositivo a dispersione laterale consente di ottenere informazioni sulla presenza di granuli intracellulari, il rapporto volumetrico del citoplasma e del nucleo.
I citometri classici, a differenza dei microscopi ottici, non consentono di ottenere l'immagine di una cellula. Tuttavia, negli ultimi anni sono stati sviluppati dispositivi combinati in grado di combinare le capacità di un microscopio e di un citofluorimetro. Saranno discussi di seguito.
Citometri per immagini
Per gli strumenti utilizzati nella citometria a flusso classica,una caratteristica è caratteristica: se nella popolazione delle cellule analizzate vengono registrati eventi rari, non c'è modo di valutarne l'essenza. Queste particelle possono essere i resti di cellule morte o un raro gruppo di esse. Nei dispositivi convenzionali, tali dati sono esclusi dal flusso generale degli eventi, ma sono loro che possono essere di particolare valore per l'analisi scientifica e clinica.
La nuova generazione di citometri a flusso per imaging consente di acquisire un'immagine di ciascuna cellula che passa nel flusso attraverso la zona del rivelatore. È facile vederlo facendo clic sull'area corrispondente del diagramma, che viene visualizzata sul monitor del computer.
Aree di applicazione
La citometria a flusso è un metodo universale utilizzato in molti campi della medicina e della scienza:
- immunologia;
- oncologia;
- trapiantologia (trapianto di midollo osseo rosso, cellule staminali);
- ematologia;
- tossicologia;
- biochimica (misurazione dell'acidità all'interno della cellula, studio di altri parametri);
- farmacologia (creazione di nuovi farmaci);
- microbiologia;
- parassitologia e virologia;
- oceanologia (lo studio del fitoplancton per valutare lo stato dei corpi idrici e altri compiti);
- analisi delle nanotecnologie e delle microparticelle.
Immunologia
Il sistema immunitario umano è costituito da un'ampia varietà di cellule. La citometria a flusso in immunologia consente di valutarne la struttura e le funzioni, ovvero di svolgere attività morfofunzionalianalisi.
Tali ricerche aiutano a comprendere la natura complessa dell'immunità. I fenotipi cellulari cambiano a causa dell'attivazione degli antigeni, dello sviluppo di patologie e di altri fattori. La citofluorometria può separare sottopopolazioni di cellule immunitarie in una miscela complessa e valutare tutti i loro cambiamenti nel tempo.
Oncologia
Uno dei compiti più importanti in oncologia è la differenziazione delle cellule in base al loro tipo. Il principio dell'analisi mediante citometria a flusso in oncoematologia si basa sul seguente fenomeno: quando un campione viene trattato con uno speciale colorante fluorescente, si lega alle proteine citoplasmatiche. Dopo la divisione in cellule che proliferano attivamente, il suo contenuto diminuisce della metà. Di conseguenza, l'intensità della luminescenza cellulare diminuisce di due volte.
Ci sono altri modi per rilevare le cellule proliferanti:
- uso di coloranti che legano il DNA (ioduro di propidio);
- uso di uracile etichettato;
- registrazione di un aumento del livello di espressione delle proteine cicline, che sono coinvolte nella regolazione del ciclo cellulare.
