PCR, o reazione a catena della polimerasi, è una sofisticata tecnica di laboratorio ampiamente utilizzata in medicina e in altri campi scientifici. La diagnostica PCR una volta è diventata una vera svolta nella scienza.
Descrizione
La PCR quantitativa è un tipo di PCR in tempo reale.
Questa è intesa come una variante della PCR, in cui viene costantemente registrata la cinetica della reazione, che permette di valutare qualitativamente il contenuto di specifiche sequenze nucleotidiche del DNA in una complessa miscela molecolare.
Il metodo PCR quantitativo sarà discusso in maggior dettaglio di seguito.
L'essenza dell'analisi
I metodi culturali e sierologici sono particolarmente usati per diagnosticare le infezioni. Sotto il primo, vengono determinati gli anticorpi contro un agente patogeno infettivo nel siero del sangue. Nella seconda, il materiale biologico prelevato da una persona malata viene utilizzato per seminare un terreno specifico favorevole alla crescita di colonie di patogeni. Diagnostica in entrambiil caso può durare giorni o settimane.
L'esame PCR può essere effettuato con diversi materiali biologici ottenuti da una persona malata. Il sangue e altri mezzi e fluidi patologici, fisiologici e biologici fungono da campioni. Puoi fare le feci o l'urina della PCR.
Le infezioni atipiche e virali sono spesso diagnosticate mediante PCR quantitativa, poiché potrebbero non essere facili da diagnosticare a causa della natura specifica del processo patologico da esse provocato. Per determinare tali infezioni, ci vuole tempo, durante il quale gli anticorpi iniziano a essere prodotti nel corpo, determinati da metodi sierologici. Ma questo è inaccettabile in alcuni casi.
Metodo di esecuzione
Metodo PCR - rilevamento in laboratorio dell'infezione in campioni isolati dal paziente (in vitro).
Per condurre una reazione a catena della polimerasi, è necessario un set di reagenti speciali.
Il materiale del test viene introdotto nelle provette con i reagenti. Le provette sono collocate in un apparato speciale: un amplificatore PCR, progettato per amplificare (aumentare il numero) dei frammenti di RNA o DNA desiderati, l'amplificatore PCR funziona in modalità ciclica. In qualsiasi ciclo, se i campioni contengono la sequenza di RNA o DNA dell'agente patogeno, nella soluzione si accumulano sempre più copie delle particelle di questi acidi nucleici. È possibile determinare la presenza dell'agente patogeno e la sua quantità nei campioni.
Tipi di PCR
L'analisi qualitativa mediante PCR consente di ottenere il seguente risultato:
- negativo quando l'agente patogeno di interesse non viene trovato nei campioni;
- positivo se nei campioni si trovano sequenze caratteristiche di un particolare patogeno.
Con un risultato PCR positivo, possiamo parlare con una precisione del 95% della presenza di un'infezione diagnosticata. Allo stesso tempo, l'accuratezza dei set PCR utilizzati a fini diagnostici raggiunge il 100%.
Di solito il 5% dei risultati errati è determinato dal fattore umano. Ad esempio, le violazioni della tecnica di analisi e conservazione dei reagenti possono ridurre significativamente l'accuratezza dello studio.
La PCR quantitativa definisce il concetto di carica virale. È possibile determinare quanti set di DNA patogeno erano presenti nei campioni prelevati dal paziente.
La gravità dell'infezione è direttamente proporzionale all'aumento del loro numero. Puoi anche determinare il successo della terapia per ridurre la carica virale.
Invio per biomateriale PCR
La PCR quantitativa viene eseguita in clinica, principalmente al mattino. Durante una visita dal medico, al paziente verrà detto cosa deve essere preso: raschiamento, strisci, urina o sangue. La PCR può rilevare agenti patogeni indipendentemente dal livello di contaminazione del materiale.
Per un'analisi positiva, in teoria, è richiesta la presenza di un solo patogeno nei campioni. In pratica, cercano di creare condizioni ancora più favorevoli. Ci sono alcuni consigli per questo:
- se prendono un raschiamento o un tampone dai genitaliorgani, è necessario astenersi da rapporti intimi tre giorni prima dello studio;
- non puoi lavarti con farmaci antibatterici o lavarti prima dell'analisi;
- tre ore prima di fare uno striscio dall'uretra, devi essere paziente e non svuotare l'intestino.
Non seguire queste regole quando doni il sangue.
Come vengono interpretati i risultati dell'analisi PCR quantitativa?
Valutazione quantitativa dei risultati ottenuti
In alcune situazioni cliniche si pone il problema dell'efficacia del trattamento e/o della dinamica del processo patologico. Tali domande sono particolarmente rilevanti quando si esaminano persone con infezioni croniche (virus dell'immunodeficienza umana, epatite B e C). Durante la diagnosi, si basano sul fatto che l'accumulo di ampliconi (prodotti della PCR) è proporzionale alla presenza di copie del gene desiderato nel campione analizzato.
Naturalmente, tenendo conto dei risultati della PCR quantitativa viene effettuata l'elettroforesi su gel con lo studio dell'intensità di segnali PCR speciali. Inoltre, un prerequisito per una corretta valutazione quantitativa dei risultati ottenuti è costituito da campioni di controllo positivi e affidabili contenenti un numero noto di copie del gene desiderato (ad esempio mille copie del gene dell'epatite C per una reazione PCR). Diverse diluizioni seriali del controllo quantitativo consentono di generare curve di calibrazione e vengono utilizzate per valutare il contenuto delle genocopie cliniche nei campioni clinici.
Nella definizione di PCR quantitativa, un risultato chiave è stata la creazionesonde di DNA fluorescenti che vengono aggiunte alla miscela di reazione contemporaneamente a semplici primer e consentono di tracciare il processo PCR nel tempo, ovvero la PCR in tempo reale.
La metodologia TaqMan si riferisce alla sintesi di sonde di DNA fluorescenti che sono specifiche per la parte centrale dell'amplicone e hanno due etichette alle estremità. Uno di questi è un'etichetta fluorescente, la seconda è una molecola quencher per questa fluorescenza.
Un dispositivo speciale, che è un ibrido tra un fluorimetro e un amplificatore a blocco termico, effettua misurazioni costanti della fluorescenza in ciascuna provetta (principio della PCR in tempo reale). Dopo 20-40 cicli di PCR, si otterranno curve individuali per ogni campione. Il numero di copie del gene desiderato contenuto nel campione di prova può essere calcolato dalle curve di calibrazione con campioni di controllo.
Inoltre, una caratteristica importante dell'implementazione della PCR con il metodo fluorescente è che non è necessario aprire le provette con una miscela PCR quando si tiene conto dei risultati. Ciò riduce la possibilità di contaminazione della stanza con i prodotti di amplificazione e non è necessario allocare aree di lavoro speciali per l'elettroforesi.
Cosa mostra una trascrizione PCR quantitativa?
Cosa viene scoperto?
Attraverso un metodo come la PCR quantitativa, si trovano cambiamenti qualitativi nei geni: inserzioni, delezioni e mutazioni puntiformi. Ma con alcuni disturbi ereditari, i sintomi corrispondenti compaiono in risposta a un cambiamento nel contenuto di alcuni geni.
GrazieL'analisi quantitativa fornisce un risultato numerico, il più delle volte in UI / ml. Ciò significa che in un millilitro del campione del test è stato trovato un certo numero di copie dell'RNA o del DNA dell'agente patogeno, misurato in unità internazionali.
A seconda dell'entità, viene diagnosticata la gravità dell'infezione. Il sangue viene solitamente analizzato per determinare la carica virale, poiché i virus si muovono liberamente nel sangue durante la malattia.
Caratteristiche
La PCR quantitativa in un esame del sangue ha due caratteristiche.
- L'analisi viene eseguita in presenza di primer o deossiribonucleosidi trifosfati, che sono etichettati con un'etichetta fluorescente o radioattiva per determinare con precisione il contenuto del prodotto PCR formato.
- Nel processo PCR, terminare la reazione prima che appaiano troppi prodotti PCR. Ciò è dovuto al fatto che nella fase finale della saturazione, quando ci sono molti prodotti della PCR, sia l'enzima stesso che i substrati agiscono come legami limitanti di questa reazione. La fine del successivo ciclo di PCR in tali condizioni non è più caratterizzata da un raddoppio del numero di prodotti PCR, vengono livellate differenze quantitative insignificanti tra i diversi campioni, che sono abbastanza chiaramente definite nelle prime fasi dopo aver attraversato una serie di cicli di reazione.
Costo della diagnostica PCR
La ricerca sulla PCR ha un costo, che dipende dal tipo di infezione da testare, dalla metodologia di analisi e dal materiale di prova. Per determinare un'infezione, dovrai cedere all'interno200-800 rubli. Viene inoltre aggiunta una tariffa per il prelievo di biomateriale - circa 400 rubli.
